siRNA轉(zhuǎn)染實驗已經(jīng)成為分子生物學研究常做的實驗之一，但很多研究者對于siRNA轉(zhuǎn)染結果的判斷還存在模糊認知，以至于無法準確判定siRNA的轉(zhuǎn)染效率和目標基因mRNA或蛋白表達水平的敲低效果。本文將從siRNA轉(zhuǎn)染陽性率、基因沉默效率和蛋白表達水平三方面來分析說明如何準確判斷siRNA轉(zhuǎn)染結果。

一、siRNA轉(zhuǎn)染陽性率

siRNA轉(zhuǎn)染陽性率一般是通過研究者轉(zhuǎn)染帶熒光標記的陰性對照，再用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染進siRNA并呈現(xiàn)出點狀熒光的細胞比例來判斷。觀察前，應用PBS清洗兩遍細胞培養(yǎng)板，將含有轉(zhuǎn)染復合物的培養(yǎng)基洗去，否則在鏡下觀察時會因為熒光背景太強而無法清晰看到轉(zhuǎn)進細胞內(nèi)的熒光點。這一點特別重要，很多研究者沒有清洗就去觀察熒光，往往會因為背景太強看不到轉(zhuǎn)進去的熒光點就誤認為沒有轉(zhuǎn)進去。還有，如果不進行清洗，細胞表面會吸附熒光標記的siRNA和細小的熒光顆粒，有時又會導致錯誤的轉(zhuǎn)染陽性判斷。另外，我們實驗室發(fā)現(xiàn)，很多沒有顯微鏡使用經(jīng)驗的研究者往往調(diào)不好顯微鏡焦距，細胞內(nèi)盡管有很多熒光點卻觀察不到，常常將轉(zhuǎn)染陽性誤認為轉(zhuǎn)染陰性。

需要特別指出的是，siRNA轉(zhuǎn)染陽性率只是判斷siRNA轉(zhuǎn)染結果的初步指標，并不是判斷siRNA轉(zhuǎn)染效果的金標準，判斷siRNA轉(zhuǎn)染效果的金標準無疑是目標基因mRNA的敲降水平。顯然，siRNA轉(zhuǎn)染陽性只是表明siRNA被轉(zhuǎn)染進了細胞，無法反映siRNA被轉(zhuǎn)染進細胞后能否被有效釋放和產(chǎn)生目標mRNA敲降作用的情況。有些研究者出于操作簡單的考慮，僅僅通過siRNA轉(zhuǎn)染陽性率去判斷siRNA的轉(zhuǎn)染效率顯然是錯誤的。

特別需要注意的是，在標記siRNA轉(zhuǎn)染實驗中，細胞內(nèi)熒光的強弱并不具備判斷意義。有些研究者認為，細胞內(nèi)熒光強表示siRNA轉(zhuǎn)染效率高，這是比較錯誤的認知。事實上，有些轉(zhuǎn)染試劑如PEI、陽離子脂質(zhì)體類試劑，轉(zhuǎn)染siRNA后胞內(nèi)熒光往往很強很亮，但是在檢測基因沉默效率時，mRNA的敲降效果卻很低。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的機理是，陽離子脂質(zhì)體或PEI類轉(zhuǎn)染試劑往往帶有較多的正電荷，通過靜電引力吸引了較多的熒光標記siRNA，轉(zhuǎn)染進細胞后由于脂質(zhì)體或PEI不能很快降解，并不能高效地將靜電吸引的siRNA釋放，導致標記siRNA聚集，從而使熒光看起來很強。但是，由于不能將siRNA高效釋放，雖然熒光很強，但目的基因mRNA干擾水平卻很低，無法達到理想的研究效果。因而，研究者以轉(zhuǎn)染的熒光強弱來判斷siRNA轉(zhuǎn)染效果往往會得出錯誤的結論。實際上，真正高效的siRNA轉(zhuǎn)染呈現(xiàn)的熒光應該是有些折光、分散于細胞質(zhì)的點狀熒光，RNAiMAX、Starvio siRNA轉(zhuǎn)染試劑等比較高效的轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染結果均是如此，而Lipo2000、國內(nèi)部分轉(zhuǎn)染試劑呈現(xiàn)的轉(zhuǎn)染結果基本上都是熒光很強但敲除效率卻不高。

二、基因沉默效率

如上所述，轉(zhuǎn)染陽性率只是一個直觀的表象指標，目的是用來初步判斷轉(zhuǎn)染試劑能否將siRNA轉(zhuǎn)進細胞，但研究者無法通過該數(shù)據(jù)來獲得準確的siRNA轉(zhuǎn)染結果。想要準確判斷siRNA轉(zhuǎn)染結果還得看“金標準”，即是目標mRNA的敲降水平，也稱基因沉默效率。那么，檢測基因的沉默效率需要注意哪些方面呢？

1）細胞死亡率

“金標準”的可信度和準確度需要建立在轉(zhuǎn)染后低細胞死亡率的基礎上，因為死亡細胞的這部分也會表現(xiàn)為目的基因mRNA表達水平的降低。因此，研究者需要選擇低細胞毒性的siRNA轉(zhuǎn)染試劑進行實驗，如RNAiMAX、StarviosiRNA轉(zhuǎn)染試劑等，以規(guī)避試劑毒性對轉(zhuǎn)染結果帶來的負面影響。

2）檢測時間

基因沉默效率的檢測時間非常重要。研究者最好在siRNA轉(zhuǎn)染后24h~48h之間進行檢測，由于細胞會分裂增殖，對于mRNA敲降水平的檢測結果有影響，因而檢測時間最晚不建議超過72小時。

3）設置內(nèi)參

RT-qPCR檢測中，合理設置內(nèi)參十分關鍵。內(nèi)參能夠有助于使檢測的樣本量中各種影響因素趨于均質(zhì)化，而不會導致實驗結果出現(xiàn)過大的偏差。但要注意的是，實驗中內(nèi)參基因不能是陽性對照所要敲降的基因，如實驗中的陽性對照為siGAPDH，則內(nèi)參要選擇細胞中其它表達量穩(wěn)定的管家基因，否則實驗的設置和結果就會出現(xiàn)問題，這點可能會被一些實驗者忽略。

三、蛋白水平

siRNA轉(zhuǎn)染后引起目的基因mRNA的降解，繼而影響其蛋白水平的表達，這是被大家廣泛所認知的一個科學事實。分子生物學的中心法則就描述了這種從DNA到RNA再到蛋白的基因表達過程：由DNA先轉(zhuǎn)錄成mRNA，然后再翻譯成蛋白的氨基酸鏈。也正是鑒于mRNA和蛋白之間的這種關系，多數(shù)人都會存在一個誤解，認為目的基因mRNA表達水平和蛋白表達水平是一致的，所以當發(fā)現(xiàn)WB檢測結果顯示蛋白水平?jīng)]有出現(xiàn)顯著變化時就產(chǎn)生了自我懷疑。其實不然，雖然兩者存在必然的影響關系，但是并不一定會表現(xiàn)出完全一致的結果。一方面，在基因表達的過程中，存在著轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、翻譯后調(diào)控等多種調(diào)控機制，甚至細胞中的信號通路可以通過翻譯后修飾（如磷酸化、泛素化等）來快速改變蛋白質(zhì)的活性，而不必改變蛋白質(zhì)的總量，所以造成蛋白水平高、低或者無顯著變化的原因就可能是多方面的。另一方面，蛋白水平檢測時間的設置也非常重要，由于轉(zhuǎn)錄和翻譯發(fā)生的時間和位點存在時空間隔，并且受細胞內(nèi)目的蛋白表達量、穩(wěn)定性、半衰期、甚至其他調(diào)控等因素的影響，所以蛋白質(zhì)水平下降的幅度與mRNA水平下降不一定成線性正比關系。通常情況下，在siRNA轉(zhuǎn)染后48小時進行WB檢測，但每個實驗中目的蛋白水平的變化快慢并不相同，研究者可采用多點采樣的方式來監(jiān)測蛋白水平的變化情況，以便于更加詳實地進行實驗數(shù)據(jù)的分析。