實(shí)時(shí)熒光定量（RT-qPCR）想必大家都不陌生，根據(jù)其實(shí)驗(yàn)步驟的不同，可以分為“一步法”與“兩步法”。目前來(lái)說(shuō)，兩步法研究者用的比較多，即是將反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增分兩步進(jìn)行，首先從RNA模板反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，得到的cDNA再進(jìn)行一次或多次不同的PCR反應(yīng)。這種方法的最大優(yōu)點(diǎn)是可以保存反轉(zhuǎn)錄后的cDNA產(chǎn)物，但對(duì)于需要對(duì)大量樣品進(jìn)行分析或定量PCR，又或是對(duì)防污染要求比較高的研究者來(lái)說(shuō)是不適用的，而一步法RT-qPCR就很好的解決了這類實(shí)驗(yàn)難題。

簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，一步法熒光定量就是逆轉(zhuǎn)錄和定量PCR在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)一步完成，使逆轉(zhuǎn)錄酶與DNA聚合酶在同一管內(nèi)同樣緩沖液條件下完成反應(yīng)，整體實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便，非常適合于研究生使用。目前，除了像Thermo Fisher此類國(guó)際生物試劑品牌，國(guó)內(nèi)的像Starvio也有用下來(lái)不錯(cuò)的一步法熒光定量試劑盒，這些試劑普遍具有以下幾個(gè)特點(diǎn):

1、操作簡(jiǎn)單

加樣環(huán)節(jié)少，兩步反應(yīng)都在一個(gè)管中完成，這種方法能克隆微量mRNA而不需構(gòu)建cDNA文庫(kù)，省略了cDNA與qPCR反應(yīng)之間體系轉(zhuǎn)換的過(guò)程，操作方便快捷，也大大提高了實(shí)驗(yàn)的效率，非常適用于高通量擴(kuò)增/篩選；

2、減少污染

cDNA合成和擴(kuò)增之間不需要打開(kāi)反應(yīng)管蓋，更少的移液步驟能夠減少污染的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)具有更少的實(shí)驗(yàn)誤差；

3、靈敏度更高

一步法反轉(zhuǎn)錄得到的所有cDNA都用來(lái)擴(kuò)增，所以相比于兩步法來(lái)說(shuō)靈敏度更高，可高出10倍，且最低可檢測(cè)到1 pg總RNA中的目標(biāo)片段，有些兩步法無(wú)法檢測(cè)到的數(shù)據(jù)，用一步法可以檢出。

此外，我們還購(gòu)買了一款國(guó)產(chǎn)品牌的一步法RT-qPCR試劑盒與Starvio的進(jìn)行了比較，結(jié)果如下圖所示，從擴(kuò)增曲線結(jié)果來(lái)看，Starvio一步染料法熒光定量PCR試劑盒反應(yīng)更為靈敏，線性范圍寬，穩(wěn)定性好。

圖1.以人的總RNA為模板，10倍系列稀釋，一步法擴(kuò)增ubiquitin基因的一個(gè)片段，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。紅線為Starvio一步染料法熒光定量PCR試劑盒的擴(kuò)增結(jié)果，綠線為國(guó)內(nèi)另一品牌供應(yīng)商的擴(kuò)增結(jié)果。