Western Blot（WB），又叫蛋白質免疫印跡，是一種基于抗原抗體的特異性結合，半定量檢測樣品中某種蛋白的技術手段。在現(xiàn)有的實驗技術中，WB仍然是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學研究中最常用的一種實驗方法，整個實驗操作過程雖看似簡單，但想要獲得好看的結果圖，卻并不容易，很多研究者得到的WB結果圖往往存在背景高，條帶不清晰，陽性信號不明顯等問題，而出現(xiàn)類似結果的原因很可能是WB封閉液用的不對，下面我們一起來了解一下關于WB封閉液的相關知識以及如何選擇WB封閉液。
一、WB封閉液的原理
在Western blot實驗中，固相載體表面（如NC膜或PVDF膜）存在許多空隙，蛋白轉移到膜上后，抗體可能會非特異性地結合到這些空白位置。WB封閉液的作用便是占據(jù)這些空白位置，避免非特異性結合，從而減少實驗背景噪聲。
二、常用WB封閉液種類及其優(yōu)缺點
WB封閉液的選擇對實驗結果的清晰度和準確性至關重要。以下是幾種常用的WB封閉液及其優(yōu)缺點：
1、脫脂奶粉：便宜，易于獲得，適用范圍相對BSA（牛血清白蛋白）窄，由于牛奶中含有生物素，如正在使用抗生物素蛋白-生物素檢測系統(tǒng)，則脫脂奶粉不適用，同時也不適用于磷酸化蛋白的檢測。
2、BSA：成分單一，適用于多數(shù)情況，但價格較高，且可能在提純過程中混有IgG（免疫球蛋白G）或其他血清蛋白，增加非特異性背景，不可封閉Fc受體（免疫球蛋白Fc部分c末端的受體），如有免疫原偶聯(lián)BSA，也不可用。
3、全血清：如胎牛血清、兔血清等，與BSA適用范圍相似，且可封閉Fc受體，但由于含有多種蛋白質，可能會與抗體產生交叉反應，導致背景信號高，且價格較昂貴。
4、明膠（gelatin）：一般魚皮明膠效果最好，不含血清蛋白，減少了交叉反應，降低了背景信號，但含有內源性生物素，不適合用于生物素-抗生物素檢測系統(tǒng)。
5、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)：是一種非蛋白質的封閉劑，為水溶性多聚物，與硝酸纖維素和PVDF膜結合快，但只在檢測小分子蛋白時比較有效。
6、快速封閉液：不含血清和生物素的單一純化蛋白，在多種抗體和抗體組合中性能良好，與鏈霉親和素系統(tǒng)兼容，15分鐘內完成封閉，適用于需要剝離和再次檢測印跡的蛋白，但由于仍含有蛋白成分，依然存在產生交叉反應的可能性。
7、無蛋白快速化學封閉液：純化學成分、不含任何蛋白成分，可避免抗體與封閉劑的非特異結合，特別適用于脫脂奶粉、BSA無法有效封閉、存在交叉反應的封閉場景，且該封閉液有助于充分暴露抗原位點，無空間阻隔，能顯著提升免疫檢測的靈敏度，封閉也僅需10分鐘，具有快速高效的特點。
三、WB封閉液的選擇標準
1、全能性
WB封閉液的“全能性”是指能夠應用于各種WB封閉場景，而不會因為存在共同抗原而導致出現(xiàn)交叉反應的性能。這一點是研究者在進行WB封閉液選擇時最需要關注的方面，也是決定目的蛋白條帶背景是否清晰、陽性信號是否明顯的關鍵要素。
顯然、像脫脂奶粉、BSA、全血清等類型的WB封閉液并不滿足這一性能，而快速封閉液由于或多或少含有蛋白抗原成分，也會有出現(xiàn)交叉反應的可能，因此建議研究者選擇WB無蛋白快速化學封閉液。據(jù)了解，市面上宣傳無蛋白的快速封閉液有很多，但真正純化學成分的WB封閉液并不多，研究者可使用像Starvio品牌的WB無蛋白快速化學封閉劑這類產品，組分是純化學成分，不含任何蛋白質抗原成分，因此對于像磷酸化蛋白檢測、一抗或二抗與牛奶、BSA存在交叉反應情況下的WB檢測尤其適用，實驗者也無需陷入封閉液選擇的困擾。
2、背景低，信噪比高
每一位研究者在進行WB實驗時，對理想實驗結果的標準都是一樣的，那就是獲得背景清晰，信噪比高的目的蛋白條帶。這一點對于封閉液來說，就非常考研其成分以及封閉性能。
我們使用了大家最常用的脫脂奶粉和市面上常見的兩款快速封閉液，在保持其他實驗條件一致的情況下，進行了封閉效果的比較。實驗結果如下圖所示，圖A為脫脂奶粉的封閉效果，目的條帶較為清晰，但稍有背景，隱約有非特異性條帶；圖C為某知名品牌封閉液封閉效果，可見目的條帶，但背景雜亂不均一，非特異性條帶較為明顯；圖B為Starvio WB無蛋白快速化學封閉劑II，目的條帶較其他兩款封閉液的結果更為清晰，信噪比更高，且背景非常干凈，可以說幾乎無背景。我們研究推測，可能是得益于Starvio的產品為純化學成分、不含蛋白抗原物質的原因，因此對蛋白轉印膜上的非特異性抗體結合位點封閉的更加徹底，也就利于特異性抗原位點的暴露，從而促進抗原抗體的特異性結合，最終提升了免疫檢測的靈敏度。
圖A為脫脂奶粉封閉1小時；圖B為Starvio WB無蛋白快速化學封閉劑II封閉10分鐘；圖C為某知名品牌封閉液封閉10分鐘。
3、封閉效率高
傳統(tǒng)WB封閉液一般使用5%的脫脂奶粉或5%的BSA（TBST配制），然后將蛋白轉印膜完全浸泡在封閉液中，室溫下封閉1 h或4℃過夜。整個封閉過程時間較久，對于一些新手或迫切想取得實驗結果的研究者來說并不友好，而且很多“實驗小白”在剛接觸到WB實驗時，尚未對每種封閉液的性能和優(yōu)缺點有明晰的認知，很可能花費了時間和精力但最后由于封閉液使用不當而導致與抗體產生交叉反應，結果不理想。因此，研究者可以選擇WB無蛋白快速化學封閉液來進行實驗，不僅可以將封閉失敗的風險降到最低，而且封閉時間也僅需數(shù)分鐘，以上述提及的Starvio的無蛋白快速化學封閉液來說，只需10分鐘就可以充分封閉，封閉效率顯著優(yōu)于脫脂奶粉和BSA。
最后，希望正在經歷WB實驗洗禮的研究者和即將開始WB實驗的新手們，都能少走彎路，取得理想的實驗結果！
